microRNA（miRNA）分子雖小，卻在基因表達(dá)的調(diào)控上發(fā)揮著重要作用。為了更好地了解miRNA影響健康和疾病的機(jī)制，我們首先需要知道m(xù)iRNA會(huì)對(duì)哪些基因起作用。然而，這并非易事。每個(gè)miRNA都能夠調(diào)控?cái)?shù)以百計(jì)的靶基因。之前的miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)主要是通過一些算法來實(shí)現(xiàn)，而Clontech公司（Takara旗下）近日推出一種新工具，能協(xié)助鑒定細(xì)胞中的miRNA靶標(biāo)。
這一工具名為MirTrap系統(tǒng)。它利用RISC蛋白的顯性失活突變體，允許miRNA與其靶標(biāo)結(jié)合，但限制進(jìn)一步的加工。此亞基整合到內(nèi)源的Argonaute/RISC復(fù)合物中，并“鎖定”miRNA-靶標(biāo)mRNA。顯性失活亞基上的DYKDDDDK（FLAG表位）標(biāo)簽允許整個(gè)Ago/RISC復(fù)合物的捕獲和分離。這樣就能實(shí)現(xiàn)miRNA及其靶標(biāo)的免疫沉淀，從而通過新一代測(cè)序或定量PCR來鑒定或定量。
整個(gè)過程大致如下：
1. 創(chuàng)建miRNA模擬物。
2. 將這些miRNA模擬物和pMirTrap載體共轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并孵育24小時(shí)。同時(shí)利用miR-132、pMirTrap載體和pMirTrap對(duì)照載體開展對(duì)照轉(zhuǎn)染。
3. 利用附帶的MirTrap分離試劑盒裂解轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)物。
4. 利用分離試劑盒中的磁珠對(duì)RISC復(fù)合物（其中包括靶標(biāo)mRNA）進(jìn)行免疫沉淀。
5. 利用附帶的NucleoSpin RNA XS試劑盒分離與磁珠結(jié)合的靶標(biāo)mRNA。
6. 通過qPCR或新一代測(cè)序分析分離出的RNA，鑒定出特定miRNA的靶標(biāo)mRNA。
MirTrap系統(tǒng)中包含了pMirTrap載體、免疫沉淀及后續(xù)分離所需的試劑、Xfect microRNA轉(zhuǎn)染試劑以及對(duì)照試劑，足夠15次分析使用。
Xfect microRNA轉(zhuǎn)染試劑也是Clontech推出的產(chǎn)品。它形成可生物降解的納米顆粒，從而實(shí)現(xiàn)miRNA的轉(zhuǎn)染。此試劑盒提供兩種轉(zhuǎn)染聚合物：Xfect MicroRNA Transfection Polymer，這是為小RNA的轉(zhuǎn)染而優(yōu)化的；Xfect Polymer，這是為質(zhì)粒DNA而優(yōu)化的。
在miRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，只需要Xfect MicroRNA Transfection Polymer；而在miRNA與質(zhì)粒DNA的共轉(zhuǎn)染時(shí)，須在轉(zhuǎn)染反應(yīng)中加入少量的Xfect Polymer。轉(zhuǎn)染過程可在血清存在時(shí)開展。
elisa試劑盒，進(jìn)口elisa試劑盒，放射免疫試劑盒，amresco，Gibco培養(yǎng)基-南京信帆生物技術(shù)有限公司
在線咨詢