(一)、ABC法：(注，下面各種方法，均為手工操作，如沒特別說明，均在室溫下進行)
1.切片經(jīng)二甲苯Ⅰ 5分鐘。
2.切片經(jīng)二甲苯Ⅱ 5分鐘。
3. *Ⅰ 30秒。
4. *Ⅱ 30秒。
5. 95%酒精Ⅰ 30秒。
6. 95%酒精Ⅱ 30秒。
7. 90%酒精 30秒。
8.80%酒精 30秒。
9. 70%酒精 30秒。
10.自來水洗。(后面的切片脫蠟至水一般都是1-10)
11.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。
12.水洗。
13.抗原修復(fù)。
14.PBS洗3次，1分鐘/次。
15.加入血清孵育20分鐘。
16.摔干血清，加入一抗60分鐘。
17.PBS洗3次，2分鐘/次。
18.加入二抗孵育30分鐘。
19.PBS洗3次，2分鐘/次。
20.加入ABC復(fù)合物，孵育30分鐘。
21. PBS洗3次，2分鐘/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分鐘。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris蘇木素染核5-10分鐘。
25.水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。
(二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln)
1.切片脫蠟至水。
2.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。
3.水洗。
4.抗原修復(fù)。
5.PBS洗3次，1分鐘/次。
6.加入血清孵育10分鐘。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分鐘。
8.PBS洗3次，每次2分鐘。加入二抗，孵育20分鐘。
9.PBS洗3次，每次2分鐘。
10.加入SP復(fù)合物孵育20-30分鐘。
11.PBS洗3次，每次2分鐘。
12.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris蘇木素染核5-10分鐘。
15.水洗，分化 ，藍化，脫水，透明并封固。
(三)真空負壓LSAB法
1.切片脫蠟至水。
2. 0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5min.
3. 水洗。
4.如果需要，可進行抗原修復(fù)。
5.PBS洗3次，每次1分鐘。
6.加入正常血清真空負壓處理5min。
7.摔干血清，加入*抗體，真空負壓處理5分鐘。
8. PBS洗3次，每次2分鐘。
9. 加入二抗(即連接抗體)真空負壓處理5分鐘。
10.PBS洗3次，每次2分鐘。
11.加入鏈卵蛋白復(fù)合物，真空負壓處理 5分鐘。
12.PBS洗3次，每次2分鐘。
13.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。
14.PBS洗，水洗。
15.染核，分化，藍化，脫水，透明并封固。
注：真空負壓即將真空干燥中抽成真空。負壓達66.7KPa(500mmHg)
(四)Envision TM Systems.
1.切片脫蠟至水。
2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
3.水洗。
4.抗原修復(fù)。
5.PBS洗3次，每次1分鐘。
6.加入一抗體孵育30-60分鐘。
7.PBS洗3次，每次2分鐘。
8.加入增強劑孵育20-30分鐘。
9.PBS洗3次，每次2分鐘。
10.加入酶標抗兔/鼠，復(fù)合物，孵育20-30分鐘。
11.PBS洗3次，每次2分鐘。
12.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris蘇木素染核5-10分鐘。
15.水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。
(五)免疫組化雙染色法。(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)
1.切片脫蠟至水。
2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
3.水洗。
4.抗原修復(fù)。
5.PBS洗3次，每次1分鐘。
6.加入非免疫性動物血清，孵育10分鐘。
7.PBS洗3次，每次2分鐘。
8.加入*抗體孵育60分鐘。
9.PBS洗3次，每次2分鐘。
10.加入生物素化的第二抗體，孵育10分鐘。
11.PBS洗3次，每次2分鐘。
12.加入鏈卵蛋白素過氧化物酶孵育10分鐘。
13.PBS洗3次，每次2分鐘。
14.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘。
15.PBS洗3次，每次2分鐘。
16. 加入雙染增強液，孵育10分鐘。
17. 加入非免疫性動物血清孵育10分鐘。
18. PBS洗3次，每次2分鐘。
19. 加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。
20. PBS洗3次，每次2分鐘。
21. 加入生物素標記的第二抗體孵育10分鐘。
22. PBS洗3次，每次2 分鐘。
23. 加入鏈卵蛋白素堿性酶孵育10分鐘。
24. PBS洗3次，每次2分鐘。
25. 加入AEC溶液，孵育5-10分鐘。
26. 自來水洗。
27. 蘇木素染核5-10分鐘。
28. 水性封片。
注：1.*種復(fù)合物也可先用鏈卵蛋白素堿性酶。
2.第1次顯色也可用BCIP/NBT溶液，顏色為藍黑色，但應(yīng)與蘇木素鑒別。
(六)、免疫組化的雙染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)
1.切片脫蠟至水。
2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
3.水洗。
4.抗原修復(fù)。
5.PBS洗3次，每次1分鐘。
6.加入選用的*抗體孵育30-60分鐘。
7.PBS洗3次，每次2分鐘。
8.加入增強劑孵育20-30分鐘。
9.PBS洗3次，每次2分鐘。
10.加入酶標抗兔/鼠，復(fù)合物，孵育
11.PBS洗3次，每次2分鐘。
12.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘
13.PBS洗3次，每次2分鐘。
14.加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。
15.PBS洗3次，每次2分鐘。
16. 加入增強劑孵育20-30分鐘。
17. PBS洗3次，每次2分鐘。
18. 加入酶標抗兔/鼠堿性酶復(fù)合物孵育20-30分鐘。
19.PBS洗3次，每次2分鐘。
20.加入AEC溶液孵育5-10分鐘。
21.自來水洗。
22.蘇木素染核5-10分鐘。
23.水性封片。
(七)細胞培養(yǎng)片免疫熒光染色法。
1.將細胞于載片或蓋玻片的片子用生理鹽水洗幾次。
2.純丙酮固定10分鐘。
3.PBS浸洗3次，每次1分鐘。
4.加入選用的*抗體孵育120分鐘。
5.PBS洗3次，每次2分鐘。
6.加入熒光抗體孵育60分鐘以上。
7.PBS法3次，每次2分鐘。
8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。
9.水洗，蒸餾水洗。
10. 水性膠封片或用緩沖甘油封片。
(八)真空負壓免疫熒光染色法染細胞培養(yǎng)片。
1. 將細胞爬于載玻片或蓋玻片的片子用生理鹽水浸洗數(shù)次，*洗去蛋白液。
2.純丙酮固定5-10分鐘。
3.PBS浸洗3次，每次1分鐘。
4.加入選用的*抗體孵育真空負壓處理15分鐘。
5.PBS洗3次，每次2分鐘。
6.加入熒光抗體孵育真空負壓處理15分鐘。
7.PBS洗3次，每次2分鐘。
8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。
9.水洗，蒸餾水洗。
10.水性膠封片或用緩沖甘油封片。
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